Aunque tanto los machos como las hembras nacen con espolones en el tobillo, sólo los del macho liberan veneno, compuesto principalmente por proteínas similares a defensinas(DLP), tres de las cuales son únicas en el ornitorrinco. Las defensinas son producidas por susistema inmunitario. A pesar que el veneno es lo suficientemente potente como para matar animales pequeños, o incluso perros, no es letal para los humanos, aunque tras una picadura pronto aparece un edema alrededor de la herida que se extiende gradualmente por el miembro afectado y causa un dolor tan intenso que ni siquiera puede ser calmado con morfina. La información obtenida de los estudios de caso y pruebas anecdóticas indica que el dolor se transforma en una hiperalgesia de larga duración que persiste durante días o incluso meses. El veneno se produce en las glándulas crurales del macho, unas glándulas alveolares en forma deriñón conectadas al espolón calcáneo de ambas patas posteriores a través de un conducto con paredes delgadas. Las hembras, al igual que en los equidnas, nacen con púas rudimentarias que no se desarrollan y caen antes de que lleguen a alcanzar un año de edad y carecen de glándulas crurales funcionales.
El veneno parece tener una función diferente a la del producido por especies no mamíferas; sus efectos no suelen ser letales, pero son lo bastante potentes como para debilitar seriamente a la víctima. Puesto que sólo los machos producen veneno y la producción aumenta durante la época de apareamiento, se teoriza que es utilizado como arma ofensiva para hacer valer su dominio durante este período.
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